在上期中，我们一起探讨了同源重组法在质粒构建中的实验步骤。但在实验过程中，有哪些需要特别注意的事项呢？让我们一同深入了解！

一、同源重组法质粒构建中的注意事项

（1）引物设计：同源臂的长度一般为15-20bp，GC含量应保持在40%-60%。计算引物的Tm值时，仅需考虑特异性引物部分，不包括同源臂和酶切位点。如果引物长度超过40bp，可以选择PAGE纯化方式来提高阳性克隆率。

（2）模板选择：在PCR扩增插入片段时，若目的片段较难扩增，可以先使用不带同源臂的引物进行克隆，再将胶回收的产物作为模板，使用带有同源臂的引物进行二次PCR扩增。但需注意，该方法可能引入较多突变。

（3）酶切与线性化：使用限制性内切酶进行载体线性化时，确保酶切完全，可以通过延长酶切时间或采用双酶切的方法来实现。如果使用单酶切，需警惕原生环状质粒残留可能导致的转化不准确。

（4）片段纯化：在胶回收过程中，务必使用新的刀片，以防外源DNA污染。同时，应确保胶回收产物的质量与浓度，以便准确计算后续使用量。

（5）比例与用量：载体与插入片段的最适摩尔比应严格控制在1:2，提高重组效率。使用未经纯化的线性化克隆载体和插入片段扩增产物时，其加入总体积不应超过反应体系体积的1/5。

（6）重组反应条件：重组反应需在冰上配置反应体系，轻轻吸打混匀以避免振荡。反应温度和时间需严格控制，一般为37℃反应30分钟，反应时间不足或过长都会影响克隆效率。

（7）转化过程：感受态细胞应在冰上解冻，加入重组产物后需轻轻混匀，以避免损伤细胞。热激时间和温度需准确把握，热激后应迅速置于冰上冷却。此外，转化产物的涂布量应适中，过多或过少都会影响阳性克隆的筛选。

（8）鉴定环节：在进行菌落PCR鉴定时，要选择合适的引物和PCR程序，以确保结果的准确性。对于初步鉴定为阳性的菌落，建议进行测序，以最终确认重组质粒的正确性。

二、同源重组法质粒构建中的常见问题

1. 若胶回收产物浓度不足以进行连接，可增加实验的起始量，因为多数胶回收试剂盒的回收率在30%~60%之间，因此在载体酶切和扩增片段时可以考虑使用200μl的跑胶体积。

2. 如果扩增的PCR产物无条带或条带较弱，需检查引物的Tm值和GC比，可能需要更换引物或调整PCR条件以达到最佳效果。

3. 若涂板后无菌落或菌落数量稀少，可能是线性化克隆载体和插入片段扩增产物使用量不足、过量或比例不佳，建议使用双酶切法切割载体，避免自连问题。

4. 若菌液PCR无条带，可能是由于载体连接不成功或引物设计问题所致。

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